“2012LSAC生命科技論壇：干細胞技術與應用”將于2012年10月17日~18日在上海新國際博覽中心與“慕尼黑上海生化分析展”同期召開。
干細胞經歷最近十年的飛速發展，從胚胎干細胞，到成體干細胞，進一步到iPS，以及這些細胞在動物實驗和臨床中應用，從小規模的臨床研究到部分干細胞產品的上市，無疑給未來的臨床應用領域提供巨大想象空間。
本次主題論壇旨在傳遞干細胞領域最新前沿進展，介紹干細胞基本研究最新技術與臨床應用。論壇將邀請國內外著名的干細胞領域專家、學者，在介紹干細胞研究領域的最新進展同時，還邀請在干細胞領域技術方面具有突破性進展的企業科學家參與演講，全面介紹干細胞領域領先的、實用新技術，促進基礎研究與臨床應用的融合。
以下是本次論壇的部分嘉賓的演講摘要，更多相關資訊可關注生物谷會議官方微博（@生物谷會議），或登錄會議官網：2012LSAC生命科技論壇：干細胞技術與應用
Modeling Rett Syndrome using human ES cell-derived neurons
Human pluripotent stem cells, including embryonic stem cells (hESCs) and induced pluripotent stem cells (iPSCs), and their differentiated progeny offer extraordinary potential for medical research as cell therapy agents and disease models. It remains, however, a challenge to reveal physiologically-relevantphenotypes and underlying molecular and cellular mechanisms of complex human disorders using hESC/iPSC-derived systems{Marchetto, #136; Saha, 2009 #137}. Neuropsychiatric disorders often involve altered neuronal network activities {Ramocki, 2008 #116; Sudhof, 2008 #123}, providing a fundamental rationale for the examination of synaptic transmission in combination with mechanistic studies in hESC/iPSC-based disease models. As a proof-of-principle study, we report here the establishment of a hESC-based model for Rett Syndrome (RTT), an autism spectrum disorder (ASD) caused by mutations of the Methyl-CpG binding Protein 2 (MeCP2) gene{Amir, 1999 #16}. We demonstrate that MeCP2-deficiency in human neurons induces a shift of spontaneous synaptic activity from primarily glutamatergic excitatory (E) to predominantly GABAergic inhibitory (I) transmission. This increased inhibitory activity is associated with an increased density of GABAergic synapses, and with abnormal expression of several genes involved in synaptic transmission and autism. Using a genetic rescue approach we confirmed the causality between MeCP2 deficiency and the neurotransmission phenotype. Such genetic rescue paradigms could serve as essential controls in other human stem cell including iPSC-based disease models. In summary, we have established a novel hESC-based model for RTT and revealed robust and measurable disease-related phenotypes. The E/I neurotransmission imbalance and shared defects in gene expression suggest that RTT and autism might have common molecular mechanisms. Moreover, we demonstrated that the overall strategy of coupling synaptic transmission and gene expression analyses to phenotype hESC/iPSC-derived diseased neurons could become a general approach to tackle other neuropsychiatric or neurodevelopmental diseases, paving the way to novel therapeutic interventions.
組蛋白修飾在誘導多能干細胞形成中的作用與機制
誘導多能干細胞（iPS）的誕生為病人的個性化治療提供了新思路，但是在iPS細胞的形成機制依然需要進一步的探究。目前認為，組蛋白修飾（酶）等表觀遺傳修飾特異性的改變尤其是組蛋白乙酰化在iPS形成中具有極其重要的作用。我們的最新研究發現特定HDAC蛋白的干擾病毒可以有效促進iPS細胞進入成熟期進而提高誘導效率和質量，這些HDAC蛋白極有可能是通過多能性標志基因Nanog及其組成的正反饋環路進而在iPS細胞形成過程中發揮重要作用，這為組蛋白修飾在iPS細胞形成中的功能和機制提供了新的理論基礎。
化學小分子增強多能干細胞的誘導
哺乳動物從受精卵發育成個體的過程一直被認為是不可逆的。而近期研究展示了已經分化的體細胞可以通過外源表達轉錄因子（包括Oct4, Sox2, Klf2, cMyc等）而被重編程回到類似胚胎干細胞的多能狀態，而這類細胞被稱為誘導多能干細胞（iPS）。iPS與胚胎干細胞非常相似，可分化為各種體細胞。四倍體互補實驗也證實iPS可以獨立發育成個體。由于不存在倫理問題及免疫排斥問題，iPS技術為干細胞的研究和臨床應用提供了有利條件。然而，外源轉錄因子及病毒載體的使用使其安全性受到質疑；而且iPS的誘導效率尚底，誘導機制也不十分明了。這一切都阻礙了iPS的應用。
利用小分子化合物來增加iPS誘導效率，并輔助解析iPS誘導機制是一條可行之路。我們建立了基于96－孔板體系的篩選體系，尋找能夠增加iPS效率并替代轉錄因子的小分子化合物，發現了一批能夠有效促進重編程的化合物，包括老藥LiCl等。
宮內膜干細胞誘導分化及其應用潛能
干細胞在特定的體內外微環境下，能夠誘導分化成為多種組織細胞，甚至是一些曾經被人們認為不可再生的組織器官，通過移植參與受者組織的再生與修復，為臨床醫學提供了一個新的充滿希望的治療手段，使得一直困擾人類的醫學難題有了新的希望，如肝病、糖尿病、癌癥、帕金森病等。我國肝病大國，肝硬化是臨床常見的危重癥，且目前缺乏有效的治療手段，病死率高。干細胞移植與傳統肝移植治療方法相比，不存在免疫排斥及倫理問題。這項技術風險小、痛苦少，利用其組織再生和損傷修復的功能，可在一定程度上改善終末期肝病患者的肝功能。
宮內膜干細胞是新近發現的間充質干細胞，符合間充質干細胞的一般標準，在體外可以穩定增殖而不發生核型的改變，具有免疫原性低，無致瘤性的特點，在體外可以誘導分化為多系細胞。該報告將從宮內膜干細胞體外誘導為肝樣細胞、動物實驗和臨床研究等領域，揭示宮內膜干細胞在肝病損傷治療中的應用潛能。
反因子核酸酶及其在干細胞基因工程與基因治療中的應用
轉錄激活樣因子（TALE）為近年發現的一類可識別堿基的氨基酸序列高度重復蛋白質，來源于一種革蘭氏陰性細菌，每一重復單元大多由33-35 個氨基酸組成，其中第12 和13 位氨基酸共同負責識別1 個堿基，目前廣泛使用的識別單元為四種，即NI 識別A, HD 識別C, NG 識別T, NN 識別G 或 A。這種與核酸堿基具有確切互補識別關系的生物模塊，可用于構建人工轉錄因子或基因工程酶，在工農業和生物醫學中具有十分重大的理論和應用價值。其中由轉錄激活樣因子與FokI 酶的核酸酶裂解中心所形成的反因子核酸酶（TAL effector nucleases,TALENs），在物種基因改造，基因治療等多方面已顯示出其他工程酶如鋅指蛋白酶與歸巢核酸酶或巨核酸酶所無法比擬的優勢。近兩年來，我們在TALE 這一具有巨大應用價值的生物元件的適配性與模塊庫的構建上，研發了高效的克隆技術，完成了包含256 個可識別任意4個堿基序列的TAL 模塊文庫，目前正在克隆一系列針對重要基因靶的TALENs。就我國科技發展而言，下列幾個方向將使未來反因子核酸酶研究的重點：(1)識別八堿基TALE 文庫的構建；(2)針對多個重要靶基因的TALENs的裝配以及剪切譜與脫靶效應測評； (3) TALENs 用于遺傳病的基因治療可行性研究; (4) TALENs 用于腫瘤的基因治療可行性研究; (5) TALENs 用于疾病動物模型構建的應用性研究; (6) TALENs 用于農作物物種改良的可行性研究。本報告將就TALENs的克隆，組裝，作用于副作用評價，在干細胞基因工程中的應用，在正向基因治療和反向基因治療中的應用等，予以較詳細介紹。
間充質干細胞的免疫調節作用
間充質干細胞（MSCs）也被稱為多能間充質基質細胞，已被證實在體內多種組織中存在，并且在組織修復與再生過程中是一種十分重要的細胞來源。在組織損傷等病理條件下，這些細胞會遷移到損傷部位。在損傷部位，通常會伴隨由先天免疫和獲得性免疫細胞產生的促炎癥細胞因子。間充質干細胞會在這些炎癥因子刺激下被激活。事實上最近已有文章報道間充質干細胞與炎癥細胞會相互作用，并且這種作用在決定炎癥反應結果的過程中發揮重要作用。
我們發現了間充質干細胞對于免疫反應有直接的影響，即在動物和人中，無論是在體內還是體外都有很強的免疫抑制作用。我們利用小鼠骨髓來源的間充質干細胞克隆與新分離的T細胞共培養時，發現間充質干細胞能夠抑制T細胞增殖以及其分泌的細胞因子。我們進一步證實了這種免疫抑制作用是IFN?與TNF?、IL-1? 或者 IL-1?三個細胞因子中的任何一種協同作用的結果。這些細胞因子的組合能夠刺激間充質干細胞分泌大量的趨化因子以及一氧化氮合成酶（iNOS）。趨化因子能夠把T細胞趨化到間充質干細胞周圍，而周圍高濃度的一氧化氮就能夠抑制T細胞反應。這種由細胞因子刺激引起的免疫抑制現象在iNOS或者IFN?受體缺失小鼠的間充質干細胞中是不存在的。而且對趨化因子受體進行阻斷也能去除野生型間充質干細胞的免疫抑制作用。在體內，野生型間充質干細胞能夠治療小鼠的GVHD，如果同時使用IFN?的抗體或者iNOS的抑制劑，這種治療作用就會消失，同樣的，iNOS或者IFN?受體缺失的間充質干細胞也沒有治療效果。野生型間充質干細胞也能夠抑制遲發型過敏反應，而iNOS缺失的間充質干細胞卻相反的有加重效果。有趣的是，我們最近研究表明人來源的間充質干細胞也同樣在受到類似的細胞因子刺激時有免疫抑制作用，與小鼠不同的是，起到免疫抑制作用的因子不是一氧化氮，而是IDO。因此，促炎癥因子能夠誘導間充質干細胞產生趨化因子和一氧化氮（小鼠）或者IDO（人），它們能夠協同作用行使免疫抑制作用。在臨床上，人類來源的間充質干細胞已經在晚期肝病病人中展示了驚人的治療效果。
同時我們發現間充質干細胞在某些情況下也能促進免疫反應。這種免疫促進作用發生在微環境中炎癥因子的量不足以刺激間充質干細胞產生足夠大量的NO時。當iNOS的活性被抑制或使用iNOS缺失的MSCs時，MSCs會在體外T細胞增殖實驗中強烈地促進T細胞的擴增。我們也在小鼠遲發性超敏反應（DTH）這一體內模型中得到了類似的結果。此外，iNOS缺失的MSCs能顯著地抑制黑色素瘤的生長。這可能是在缺乏NO的情況下，MSCs產生的趨化因子能促進免疫反應。事實上，在趨化因子CCR5和CXCR3雙敲除小鼠體內，iNOS缺失的MSCs抑制黑色素瘤生長的能力被大大削弱了。因此，NO在MSC介導的免疫調節作用中發揮了類似調節開關的作用。更重要的是，我們在人體來源的MSCs中發現了其對免疫系統有類似的雙效免疫調節作用。在這一調節過程中，吲哚胺雙加氧酶（IDO）發揮了調節開關的作用。這一研究為我們理解MSCs在病理及生理過程中的作用提供了新的信息。
間充質干細胞在體外培養時具有強大的增殖能力，足夠為體外和體內研究使用。對于其免疫調節的性質的進一步研究會為其臨床應用提供至關重要的信息。
人骨髓基質干細胞源性神經元的形成及對損傷脊髓的保護作用
腦或脊髓的創傷或退行性疾患如脊髓損傷（spinal cord injury）、ELISA等多種方法證實了這一結果。細胞移植入大鼠損傷脊髓后，大鼠的運動及感覺功能均有不同程度的改善，細胞能夠存活、但存活率還有待改善，如何能夠增加植入體內細胞的存活率，是我們今后進一步關注的重點。
干細胞在炎癥相關的肝病中作用及應用前景
干細胞是一類具有自我更新能力的多潛能細胞，在一定條件下可分化為多種功能的細胞。不但在疾病治療和再生醫學領域顯示了廣闊的應用前景，同時干細胞及其微環境異常也與許多疾病的發生密切相關。相關研究不但有助于干細胞應用，同時有助于相關疾病發病機制認識。炎癥相關肝病是影響國人健康的一類主要疾病，包括肝炎、肝硬化及肝癌。這類疾病均伴有炎癥損傷和修復，干細胞與這類疾病發生發展密切相關，但其確切作用及機制不清。間充質干細胞（MSCs）具有向組織損傷部位特異性趨化的特性，因此MSCs可特異性趨化至肝臟損傷部位參與修復。一方面MSCs具有多向分化潛能，可通過直接分化為成體細胞達到修復損傷的作用；另一方面，MSCs的免疫抑制功能在減輕肝臟炎癥相關的肝損傷方面起到重要作用。MSCs表達I類主要組織相容性復合體而不表達II類主要組織相容性復合體及B7-1, B7-2等，這使得MSCs免疫原性較弱。輸注同種異體MSCs甚至異種MSCs，一般不易引起宿主的免疫排斥反應。在MSCs對T細胞的免疫抑制過程中，細胞間接觸及可溶性因子的作用均十分重要。目前多種免疫抑制相關因子包括TGF-β、IL-10、Prostaglandin E2(PGE2)、Hepatocyte growth factor (HGF)、Indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO)及 Inducible nitric oxide synthase (iNOS）均與MSCs的免疫抑制功能有關。趨化至肝損傷部位的MSCs可通過其免疫抑制功能有效降低肝臟炎癥相關的損傷，保護肝功能。因此，MSCs在炎癥相關的肝病治療中對于肝功能的保護和恢復可能起到重要作用，具有非常廣闊的臨床應用前景。
靶向腫瘤干細胞治療癌癥的新策略
腫瘤干細胞是一群具有自我更新、多向分化潛能、具有啟動和重建腫瘤組織表型能力的腫瘤細胞。前期研究均表明，腫瘤干細胞形成于腫瘤早期甚至癌前病變，始動腫瘤發生和演進；腫瘤干細胞具有多向分化潛能，是腫瘤成分多樣性和分化異質性的原因；腫瘤干細胞具有高侵襲性，是轉移的源泉；腫瘤干細胞抵抗化療和放療，是腫瘤復發的根源；腫瘤干細胞始動和促進血管生成，為腫瘤提供營養；腫瘤干細胞具有抑制免疫細胞活性并參與腫瘤免疫逃逸機制的形成。因此，靶向腫瘤干細胞的治療策略將有望為癌癥的治療帶來希望。
我們課題組成功的從肝癌組織中，分離出多能轉錄因子Nanog高表達的新型肝癌干細胞。證實Nanog陽性的腫瘤細胞具有更強的自我更新、克隆形成和腫瘤起始能力。他們參與腫瘤的復發和對化療藥物的耐受。進一步研究發現，Nanog不僅可作為腫瘤干細胞的分子標志物，同時它可通過IGF信號通路參與腫瘤干細胞的自我更新。并建立以腫瘤干細胞為平臺和Nanog為靶點的高內涵藥物篩選平臺，已篩選出多個靶向腫瘤干細胞的小分子化合物和特異性單克隆抗體。通過該項研究，我們發現HDAC抑制劑可誘導腫瘤干細胞的分化，導致腫瘤干細胞對化療的敏感性，聯合分子靶向藥物Sorafenib成功的治療肝癌。
異基因間充質干細胞移植治療自身免疫病
間充質干細胞( MSCs)是來源于發育早期中胚層的多能干細胞，具有高度自我更新能力和多向分化潛能，廣泛存在于全身多種組織器官，可在體外培養擴增，并能分化為神經細胞、心肌細胞、成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞等，在細胞替代治療及組織工程方面具有極大的應用價值。
我們用異基因正常鼠、人骨髓或臍帶來源MSCs移植狼瘡鼠（MRL/lpr），發現移植后尿蛋白顯著下降，疾病活動相關指標得到改善，且腎臟病理學變化明顯減輕, 移植過程中及移植后均無排斥反應發生。同時發現經外周靜脈輸注的異基因MSCs可遷移到病變小鼠脾臟、腎臟、肝臟、皮膚等組織，上調脾臟及淋巴結組織Foxp3+Treg比例及抑制炎癥趨化因子HMGB1、MCP-1表達。新近研究發現輸注體外擴增的自體或異體骨髓來源MSCs可明顯降低膠原誘導關節炎（CIA）小鼠關節評分，抑制骨質破壞。這種治療作用的發揮除MSCs顯著抑制Th1細胞分化外，還表現為MSCs可上調Treg比例、促進Th2細胞分化；同時有研究表明MSCs的成骨、成軟骨分化功能也在其促進骨質修復方面發揮重要作用。MSCs可通過抑制Th1及Th17細胞分化及相關因子的表達，上調Treg及促進Th2細胞分化，發揮抗炎及免疫調節作用，減小MS模型鼠大腦病變范圍，降低MS疾病評分，且不同種屬及組織來源MSCs均可發揮治療作用。
我們自2007年3月在世界上首次開展異基因MSCs移植治療重癥難治性SLE患者，取得顯著臨床療效。異基因骨髓或臍帶來源MSCs移植可降低SLE患者疾病活動性評分，改善蛋白尿、腎功能及血清學指標，延緩系統受累，誘導疾病緩解，減少激素及免疫抑制劑用量，減輕藥物相關并發癥。對其機制方面的研究發現，正常MSCs可上調SLE患者外周血Treg細胞數量，抑制Th2體液免疫反應，抑制抗體產生，糾正患者體內細胞及體液免疫失衡。
此外，我們開展了異基因MSCs移植治療其他自身免疫病的臨床研究，發現MSCs移植可顯著降低難治性RA患者DAS評分，改善生活質量，上調外周血Treg水平。對于難治性多發性肌炎/皮肌炎患者，異基因MSCs移植可較好控制血清肌酸激酶水平，減少激素及免疫抑制劑用量，延緩疾病進展。同時，MSCs對SSc、原發性干燥綜合征，炎癥性腸病 、1型糖尿病 、白塞病 、多發性硬化等自身免疫病均有較好的治療作用，可誘導疾病緩解，減輕影像學及病理學改變，改善患者生活質量評分，改善免疫病相關系統并發癥如間質性肺炎、難治性皮膚潰瘍、難治性血細胞減少等。部分患者移植后病情有所復發，給予多次異基因MSCs輸注仍有臨床療效,至今已完成360例患者的治療。
臨床級干細胞技術標準與管理規范
當今是一個細胞治療技術的快速發展與市場亂象并存的現狀，外媒對中國細胞治療市場的質疑聲聲。其主要原因在于缺乏統一的標準和規范，導致臨床濫用，亂象叢生 ，缺乏系統的科學的客觀評價和專家認同；其管理辦法、監管機制、審批機構、申報程序、審批標準等政策法規相對滯后，管理監管缺失缺位，致使各級衛生行政部門承擔著巨大的政策和管理風險，也嚴重影響了細胞治療的科學發展和可持續發展，也給患者帶來了潛在的醫療和倫理風險。因此，亟待建立創新性管理思路，建立標準化規范化的有效、安全、可控的臨床細胞治療技術平臺，配備合適的硬件設施、管理人員、管理體系和對其有效性、安全性、可控性的量化評估。確保獲取高純度、高質量、無污染的臨床級細胞。
成體間充質干細胞轉決定的分子機制
目的：近來的研究表明小RNA具有調控干細胞自我更新和定向分化的功能，間充質干細胞能分化為三胚層的一些細胞。但至今尚不清楚成體間充質干細胞轉決定為其他干細胞（如造血干細胞）的分子機理，不能獲得大量的轉決定后均一的干細胞群，也不清楚小RNA怎樣調控此過程的發生。由于對這些問題的深入和全面地研究，有助于了解成體干細胞橫向分化的分子機制，有助于獲得臨床級的干細胞用于疾病的治療，也有助于解決干細胞應用中的許多實際問題。
方法和結果：在國家"863"專題的支持下，我們使用易于獲得的人體脂肪間充質干細胞為研究對象（不需要配型、不需要干細胞庫，無免疫排斥，可大量擴增），通過生物信息學和小RNA芯片篩選和鑒定一組新的人內源性小RNA，在我們自主研制的多肽納米運載系統的幫助下，高效地將它們導入（轉染率大于98%）間充質干細胞，從而獲得了高轉化率（大于80%）的造血干細胞以及相應的三系血細胞。通過體外的造血干細胞和主細胞的集落形成試驗和體內的造血系統重建試驗驗證了這些誘導的造血干細胞具有長期的自我更新能力和向各種血細胞的分化能力。
結論：為解決我國的血荒問題提供了新的技術和途徑，為人工造血提供了新的思路和方法，使血液病包括白血病的個體化治療成為可能。這一革命性醫療技術的深入和推廣，將形成巨大的社會效益和每年數億至數百億元人民幣產值的可觀的經濟效益。(生物谷 Bioon.com)
